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一文解决蛋白酶K遇到的这些问题

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一文解决蛋白酶K遇到的这些问题

2021/09/06 17:05
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1.什么是蛋白酶K

蛋白酶K是一种内肽酶,属于丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶组。在分子生物学实验室中,蛋白酶K通过降解和灭活蛋白质在DNA或RNA样品的制备过程中很有用。

2.蛋白酶K活化的合适温度是多少?

蛋白酶K活性随温度升高(达到某个点)。合适温度范围在50-65˚C之间。较高的温度有助于蛋白质解折叠,从而降低蛋白酶K分解这些蛋白质的能力。

3.蛋白酶K如何参与细胞裂解?

当涉及细胞裂解时,尤其是下游DNA分离和纯化时,蛋白酶K可以通过消化表面蛋白成为裂解步骤的一部分。进一步进入该程序,当需要在含有蛋白酶K的缓冲液中重悬和裂解细胞核时,蛋白酶K将帮助消化否则会降解样品的蛋白质。

4.蛋白酶K如何用于哺乳动物DNA分离?

从哺乳动物细胞和白细胞中分离DNA的第一步是裂解细胞并将其旋转以收集沉淀。悬浮后,加入去污剂(SDS)以破坏核膜。蛋白酶K消化蛋白质后,组蛋白和非组蛋白都会释放DNA。此外,蛋白酶K会消化溶液中的核糖核酸酶并使其失活。

5.蛋白酶K可以用于RNA分离吗?

在RNA分离过程中,蛋白酶K的加入会在底物存在的情况下降解和灭活甚至微量的核糖核酸酶。额外的苯酚氯仿和异丙醇沉淀步骤减少了蛋白质污染,并使最终的沉淀更容易重新溶解。

6.蛋白酶K与钙的关系究竟是什么?

蛋白酶K与两个Ca2+离子结合,这有助于保持酶的稳定性,尤其是在温度升高时。钙还可以保护蛋白酶K免于自溶。虽然钙有助于维持蛋白酶K的热稳定性,但它不是蛋白水解活性所必需的。

7.EDTA会灭活蛋白酶K吗?

螯合剂如EDTA或EGTA对蛋白酶K的酶活性没有直接影响。在DNA或RNA纯化过程中使用EDTA和蛋白酶K的原因是为了去除钙。但由于钙与蛋白酶K的稳定性有关,添加EDTA会对钙产生影响,从而在一定程度上降低蛋白酶K的活性。

 

 

 

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