显色底物DA64及DA67的应用原理及使用示例

一、DA64-DA67的应用原理

过氧化氢是用于生物体中痕量组分分析、环境物质等检测的中间体。DA-64和DA-67经过过氧化物酶的配合后具有高灵敏度可以检测出过氧化氢，是一种水溶性显色试剂。相对于传统显色试剂，DA-64和DA-67水溶性和高灵敏度都有优势，不必在为了提高灵敏度选择发光、荧光试剂。用比色计就可以获得结果，不仅简单而且快捷。DA-67的优点是比DA-64更抗共存物质的影响，特别适用于生物体成分样本的检测。

二、DA64-DA67的使用说明

1.制备显色溶液  

① 把4.08 mg DA67和1 mL100 units/mL的过氧化物酶(POD)放到配置的的PIPES缓冲剂中溶解，定容溶液至100 mL（DA67 100 μmol/L溶液）；

② 将上述制备的溶液3 mL与10 μL样本溶液（H2O2:0~5 mmol/L）混合，37°C条件下培育5分钟；

③ 用分光光度计检测666 nm处的吸光度，以空白（用蒸馏水替换样本溶液混合成的溶液）的吸光度差作为检测值，用单独制备的校准曲线确定样本中的含量。

2.制备检测POD活性的显色溶液

① 把4.08 mg DA67和1 mL H2O2（2%）加到配置好的Mcllvaine缓冲液中溶解（PH值5.7），定容至100 mL；

② 将上述制备的溶液2 mL与2 mL样本溶液（1 fmol~1 pmol/tube POD）在37°C下孵育；

③ 用分光光度计检测666 nm处的吸光度，以减去空白的吸光度差作为检测值，用另外制作的校准曲线即可确定样本中的含量数值。