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Folin酚法检测蛋白原理及采用缓冲剂EPPS、Tris等注意事项

2019/08/22 17:30
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Folin酚法检测蛋白含量时通常用EPPS(HEPPS)作缓冲剂。Folin—酚试剂法是由测定蛋白质浓度的基本方法,在生物化学领域得到广泛的应用。

Folin酚法的显色原理与双缩脲方法是相同的(但EPPS不能用于缩二脲/双缩脲)检测,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

Folin酚法检测蛋白含量的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时较长,要严格控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团,如-CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应,而且对后者的影响还要大得多。此外,酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。

Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠,氢氧化钠,硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下,与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用,生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下,易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应,其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg蛋白质。

需要注意的是:

1.Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定,而Folin-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当Folin-酚乙试剂加入后,应迅速摇匀(加一管摇一管),使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

2.血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内,若超过此范围应将血清酌情稀释。

德晟科技自05年就开始研发生产血液检测体外诊断方面试剂,对色原底物新型Trinder's试剂、生物缓冲剂及化学发光试剂有着较深的研究。

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