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Tris-HCl缓冲液在SDS-PAGE中的应用

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Tris-HCl缓冲液在SDS-PAGE中的应用

2019/08/23 17:34
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三羟甲基氨基甲烷Tris也叫做 氨基丁三醇;缓血酸胺;2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇,是一种弱碱,是常用的缓冲剂 Tris用途广泛,通常被用来作为缓冲液来溶解核酸和蛋白质,是蛋白质电泳、DNA电泳的缓冲液的主要成分之一。

Tris常用作生物缓冲液,常配成pH值为6.8,7.4,8.0,8.8。其pH值随温度变化很大。一般来说,温度每升高一度,PH值下降0.03。1M Tris-HCl 6.8和1.5M Tris-HCl 8.8是SDS-PAGE最常用的试剂。

SDS-PAGE是常用的一种聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术,用于分离蛋白质寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳Native-PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)

SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂SDS即十二烷基硫酸钠)后,蛋白质亚基电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。

SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素,当然其他的因素也可以从多方面考虑。

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