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生化实验中微球吸附及缓冲液的使用

2019/08/29 17:30
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在生化试验中,微球主要是使抗原、抗体、蛋白质和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面,这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附,通过引入其它活性基团如氨基和羧基的共价结合,以及通过表面改性后的亲水键结合。不同机制吸附时,缓冲剂的使用也不同。

乳胶反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球,都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团pka大约为2,因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团,但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团,在pH5.0以上时保持稳定。

带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合,是最简单和直接的标记方法。这种方法中,微球溶液和含目标蛋白的溶液混合,反应后,未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去,从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球(硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球)。醛基表面修饰微球是一个特例,其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的,但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响,从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般,在被吸附蛋白等电点附近pH时,物理吸附效率会很高。

微球共价结合抗体方法:在EDAC存在下,NHS通过与微球上的羧基反应形成中间活化酯。活化酯比EDC更稳定,不易水解。像德晟科技做的新型吖啶酯也是加入了NHS活性酯基团,能直接和蛋白质或抗体结合。

reaction buffer的组成根据蛋白种类的不同而改变,常用buffer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液。蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上,然而最终的反应缓冲液的选择,还是要考虑最终抗体微球复合物的生物活性,因此几个不同浓度的抗体和不同的反应缓冲液应该进行优化选择。

用于清洗微球的缓冲液buffer应该和storage buffer一样,用于清洗的buffer的缓冲液成分及pH的改变,都会引起蛋白的脱落。

德晟科技自05年就开始研发生产血液检测体外诊断方面试剂,对色原底物新型Trinder's试剂、生物缓冲剂及化学发光试剂有着较深的研究。

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