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Tris缓冲剂在电流滴定法测定蛋白质中的巯基的应用

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Tris缓冲剂在电流滴定法测定蛋白质中的巯基的应用

2019/09/04 17:30
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氨丁三醇即三羟甲基氨基甲烷,简称Tris,广泛用作生化反应中的生物缓冲剂。在电流滴定法测定蛋白质中的巯基时,通常使用Tris缓冲剂

电流滴定又称安培滴定,利用扩散电流的变化以确定终点的滴定法。所用检流计和电极均与极谱法相同。其指示电极为滴汞电极或铂丝微电极。电流滴定是以极谱法为基础的电化学分析法,是以微电极上发生离子扩散氧化或还原作用所产生的极限电流与离子浓度关系极作为定量分析的方法。

在组成蛋白质的氨基酸中像半胱氨酸(CySH)和胱氨酸(CySSCy)就含有巯基-SH或-SS-,测定方法通常用电流滴定法。在溶液有颜色、混浊及存在的各种复杂成分,使容量分析法和比色法在操作过程中带来困难,或因严重干扰而不适用;而微库仑滴定法不受颜色和浊度的影响,在滴定过程中不受支持电解质及微电极特性的影响,温度条件也不严格,只要被分析物质加入的滴定试剂或反应生成物其中之一能与电极发生作用,便可进行定量分析滴定。但必须满足的基本条件是:外加于二个电极的电压在反应电极上足够发生扩散电流,而且要求扩散电流达到极限电流的状况。

以蛋白质中的半胱氨酸的巯基为例, 在pH5左右,CySH 中的巯基在10-1~10-4mol/L范围内对硫电极产生约50mV 亚Nernst响应,Hg2+(也可用银离子等作滴定剂)对硫电极也产生约70mV的超Nernst响应。以 Hg2+滴定CySH中巯基时,发生络合反应2CySH+ Hg2+==Hg(CyS)2+2H+ 反应的K =1043 。当滴定至终点时,巯基量的剧减和Hg2+量的剧增使硫电极产生电位突跃,指示终点到达。若是胱氨酸,则可先与NaHSO3定量反应生成半胱氨酸在滴定。

由于络合反应的K非常大,反应迅速完全,终点突跃十分明显,勿需绘制滴定曲线即可确定终点。选择 HAc-NaAc缓冲液或者更好的Tris缓冲液作底液较为适宜。同时在测定过程中,尽可能少用缓冲液,以降低滴定介质的离子强度,增加终点电位突跃值,提高方法的灵敏度。

德晟科技自05年就开始研发生产血液检测体外诊断方面试剂,对色原底物新型Trinder's试剂、生物缓冲剂及化学发光试剂有着较深的研究。

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