TRIS缓冲液在琼脂糖电泳提取质粒中的应用

Tris（三羟甲基氨基甲烷）为弱碱，在室温25℃下，它的pKa为8.1，有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一般加入盐酸以调节pH值到所需值，即可获得该pH值的缓冲液。由于Tris缓冲液为弱碱性溶液，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性。如果将调节pH值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE缓冲液”（Tris/Acetate/EDTA），而换成硼酸则获得“TBE缓冲液”（Tris/Borate/EDTA）。这两种缓冲液通常用于核酸电泳实验中。由Tris配成的TAE，TBE等是DNA电泳常用的试剂，TE（pH8.0）主要用于溶解DNA。（TE为Tris加EDTA合称。）1MTris-HCl6.8和1.5MTris-HCl8.8是SDS-PAGE常用的试剂。

在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用很广泛。琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

操作步骤：

①　TE 缓冲液：（ 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ）

电泳缓冲液（ 50XTAE ）

②　 电泳缓冲液（ 50XTAE ）：Tris 242g， 冰醋酸 57.1ml，EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml

使用时用蒸馏水稀释 50 倍。

③　样品缓冲液（ 6X ） ：0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯青， 40% （ W/V ）蔗糖

④　STET 缓冲液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris ）

1) 量取 100毫升TAE电泳液，加入0.7克琼脂糖，混匀后，置于微波炉中，加热
3分钟，充分溶解琼脂糖。 

2) 用灭菌后的橡皮胶，封闭清洁干燥的电泳板，并用少量的琼脂糖液封边。安放梳子，调整梳子的底部边缘与电泳板之间的距离，一般以 1-2毫米为宜。

3) 当溶解后的琼脂糖液冷却至到500 C左右时，加入溴化乙锭5 m l ，溴化乙锭的最终浓度为1.0 m g/ml . 混匀后，将琼脂糖液倒入电泳板中，静止，切勿移动。

4) 在凝胶完全凝固后（于室温放置 30-45分钟），轻轻地取出梳子，除去胶带，将凝胶放入电泳漕中。

5) 电泳漕中，加入电泳液（ 1 ′ TAE），使电泳液覆盖在琼脂糖胶面之上约1-2毫米。

6) 取质粒提取液（酶切），加入 1/5样品缓冲液，充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中，分别加入DNA分子量标记物（ marker ），对照以及质粒提取液（酶切）样品

7) 接通电源，在 90V下，电泳1小时，当溴酚兰颜料迁移到凝胶前沿时，切断电源。

8) 取出凝胶，在紫外灯下，观察 DNA的迁移位置。

德晟公司研发生产TRIS、TRIS-HCl缓冲剂以及CAPS、MOPS、TAPS等缓冲剂，可以满足各种不同实验需求，另我们已经取得了小师弟琼脂糖凝胶试剂盒的代理权，可提供琼脂糖预制胶，省却制胶的繁琐步骤，使您的实验完成的更加省时顺利。