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琼脂糖预制凝胶电泳的实验原理

2020/07/12 13:30
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琼脂糖预制凝胶本质上和普通的琼脂糖凝胶是类似的,只不过是提前大批量把凝胶做好,并提前进行核酸染料预染,省去在进行核酸电泳时大量制胶时间和购买及使用核酸染料的步骤,本文介绍基本的琼脂糖凝胶电泳原理。

琼脂糖是什么?

琼脂糖Agarose,缩写为AG,是琼脂中不带电荷的中性组成成份,也译为琼胶素或琼胶糖,是线性的多聚物,基本结构是1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链,在水中一般加热到90℃以上溶解,温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。琼脂来源于红藻的多糖,由琼脂糖与琼脂果胶组成,琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似,但带硫酸根和羧基组分,凝胶能力差。

去掉琼脂中的琼脂果胶,剩下的就是琼脂糖,其凝胶效果很好,广泛用于食品、医药、化工、国防等领域,在生化实验中广泛的用于蛋白质、核酸DNA/RNA的电泳实验。

 

琼脂糖用作分子筛和电泳支持介质的原理:

琼脂糖形成凝胶后,具有稳固的网状结构,物质分子通过时会受到阻力,分子越大,电泳时阻力越大,因此带电颗粒(蛋白质、核酸DNA或RNA)的迁移率不仅与电荷性质有关,颗粒分子大小有关,这一点大大提高了琼脂糖电泳的分辨率,尤其是用于核酸研究中。

蛋白质及核酸在不同pH下所带电荷不同,在同一电场中,跑速不同及迁移率不同,因此电泳后可以将不同的蛋白质或核酸分开。电泳缓冲液pH在6~9之间,离子强度0.02~0.05为适合标准,琼脂糖浓度1%-2%。琼脂糖凝胶的分辨率大约是100bp的DNA片段,比聚丙烯酰胺凝胶稍低,但其分离范围广,能分离0.2-20kb的DNA片段,用脉冲电泳,可分离达到1千万bp的DNA片段。

琼脂糖胶、电泳液及loading buffer

核酸DNA分子在琼脂糖凝胶电泳时用电荷效应和分子筛效应,在高于等电点的pH溶液中DNA带负电荷,向正极移动,在琼脂糖骨架中,相同数量的双联DNA几乎具有等量净电荷,迁移速率也相同。

通常用的琼脂糖凝胶电泳使用的电压是200V甚至150V以下,电泳时间30分钟以上可能会更长,德晟的琼脂糖预制胶搭配高压快速电泳液不仅可以低压电泳,还可以使用450V高压快速电泳,电泳时间只需5-10分钟,大大提高了电泳效率,省时省力且省钱。

 

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