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用PIPES缓冲液制备超级感受态大肠杆菌

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用PIPES缓冲液制备超级感受态大肠杆菌

2020/07/16 13:30
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PIPES中文名哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)CAS号5625-37-6,分子量为302.368是一种常用的生物缓冲剂,pH缓冲范围是6.1-7.5,不溶于水,溶于NaOH水溶液。在制备大肠杆菌感受态实验中常用以维持溶液的pH 值,使其不会有明显的波动。
可以用HEPES等其它的试剂,但PIPES效果是首位的。

不同于含二(2-羟乙基)氨基基团的缓冲剂(如Bis-tris,Bicine),PIPES与多数金属离子不能形成稳定配合物,适用于含有金属离子的溶液体系中的缓冲剂。根据已有的研究结果,PIPES可被应用于使用磷酸纤维素色谱纯化微管蛋白,用于凝胶过滤法纯化重组GTP结合蛋白ARF1和ARF2,作为缓冲液从大肠杆菌中结晶转酮酶。另外,由于PIPES能形成自由基,因此不适合应用于氧化还原体系。用于阳离子交换色谱法,低浓度的PIPES缓冲液相比高浓度的更加合适,这是因为生物缓冲剂PIPES具有相对较大的离子强度,而且其pKa值具有浓度依赖性。

PIPES成品 

制备超级感受态大肠杆菌时PIPES的配制:

1、0.5mol/LPIPES(pH 6.7): 称取15.1gPIPE溶于80ml水中,用5MKOH调节pH6.7,定容100ml(调节pH之后才能溶解),在超净台中,用无菌滤器过滤无菌试剂瓶中,分装于-20℃保存。

2、LB平板,LA平板,50ml锥形瓶1个(含10mlLB培养基),500ml锥形瓶2个(含100mlLB),圆底50ml离心管4个,一饭盒1.5ml离心管,黄色枪头1盒,白色枪头1盒,分别用报纸包好灭菌备用。

实验步骤:

1.用接种环,平板画线接种DH5αLB培养基上,倒置培养12-16h。

2.挑取单克隆,接种于10mlLB培养基中,培养8-16。

3.分别取4ml、2ml菌种,接种至100mlLB培养基中(需要使用500ml的三角瓶),18℃,250r,培养18h左右,其中一瓶细菌OD600值达到0.45-0.6之间,丢掉另外一瓶,每小时测定一次。

4.将三角瓶置于冰中10min(以下步骤能在冰上就放在冰上,在空气中的时间越短越好)。

5.将细菌分装至四个50ml圆底离心管中,于4℃,4000r,离心5min(离心机需提前预冷)。

6.离心结束弃去上清,再瞬时离心,用移液器吸去残留培养基。

7.每个离心管分别加8mlInoue转化缓冲液,轻轻摇晃、颠倒混匀(可以在离心管上大约做好8ml的标记,一定要轻轻混匀,不能用枪头吹打)。

8.于4℃,4000r,离心5min。离心结束弃去上清,再瞬时离心,用移液器吸去残留缓冲液。

9.每管加2mlInoue缓冲液,轻轻摇晃、颠倒混匀(一定要轻轻混匀,不能用枪头吹打)。混匀后4管合并成一管。

10.加入0.6 mlDMSO,轻轻混匀,冰上放置10min。

11.于冰上分装1.5ml离心管中,每管分装200ul、400ul等(分装用枪头可以放在冰箱里预冷)。置于-80℃保存。

湖北新德晟材料科技有限公司生产的生物缓冲剂PIPES,其成品纯度高,≥99%,生产工艺稳定,供货及时,产品常温下即可保存,使用时现配即可。

 

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