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病毒核酸检测全步骤竟然如此繁杂

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病毒核酸检测全步骤竟然如此繁杂

2020/07/27 17:05
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很多人都做过核酸检测,用病毒拭子采样管进行采样看上去是比较简单迅速的,其实对于整个检测来说,这还只是一个开始,后续的灭活、核酸提取、PCR扩增分析才是重点,用病毒保存液来灭活病毒也只是减少了水浴等灭活流程,来看看完整的检测流程有多复杂。

1. 在试剂配制去准备AW1、AW2和Carrier RNA;

2. 在AW1中加入无水乙醇130mL;

3. 在AW2中加入无水乙醇160mL;

4. 加入无水乙醇后及时做好标记;

5. 在310ugCarrier RNA中加入310uLAVE并颠倒混匀,充分溶解;

6. AW1、AW2、Carrier RNA配制完成,通过传递窗送到样本处理区或专人送到核酸提取实验室  ;

7. 样本的裂解取消毒无菌1.5mL的EP管;

8. 用移液器取560uL AVL裂解液;

9. 在AVL裂解液中加入5.6uLCarrier RNA;

10. 加入140uL灭活的待提取样本;

11. 样本涡旋振荡15秒钟;

12. 室温静置15分钟裂解样本;

13. 将EP管放入离心机内离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物,防止污染;

14. 裂解完成后加入560uL的无水乙醇,震荡混匀15秒;

15. 再次放入离心机离心,去除可能的管盖残留;

病毒核酸检测

16. 向离心柱加入裂解产物630uL;

17. 8000转离心一分钟,若离心机在生物安全柜外,每次离心需要对外表面进行消毒处理;

18. 更换新废液收集管,从离心机小心取出样品,将上层离心柱 取出放入新收集管中;

19. 继续讲剩余裂解产物630uL转移到离心柱中,样本多于140uL时,重复这些步骤,知道所有样本均完成过柱离心;

20.  取500uL AW1加入到离心柱中,注意吸头接触离心柱内壁;

21. 8000转离心一分钟;

22. 小心取出离心柱,更换新的收集管;

23. 取500uL AW2加入到离心柱中

24. 14000转离心3分钟

25. 取出离心柱,更换新收集管,最大转速离心1分钟 ,确保洗液残液完全分离

26. 取无菌1.5mLEP管收集核酸

27. 讲离心柱上端小心放入1.5mLEP管中

28. 取40-60uL的洗脱液AVE加入到离心柱中,洗脱液应全部覆盖

29. 用EP管盖盖住离心柱

30. 用无菌剪刀剪去离心柱管盖

31. 室温静置1分钟

32. 将EP管放入离心机8000转离心1分钟,回收核酸

33. 丢弃离心柱,EP管中即为提取的核酸,做好登记。有条件的可以用机器提取核酸。

34. PCR体系配制,某品牌为例

 反应液:Test 12uL/(n+5)Test 12*(n+5),酶 4uL/ 4*(n+5),引物4uL 20uL/4*(n+5) 20*(n+5),核酸5uL 25uL/5uL 25uL。

35. 另一个工作人员进入另一单独试剂配制实验室,根据检测数量配制体系

36. 将配置好的PCR体系充分混匀,放入离心机

37. 通过传递窗送到核酸独立加样检测区

38. 按每孔20uL反应体系进行分装

39. 每孔分别加入5uL待测样本核酸或阴阳对照,每次检测需包含1个阳性对照和3个阴性对照,阴性对照区随机分布

40. 密封PCR管,有条件的加样可在单独的生物安全柜内完成

41. 传递窗或专人送入PCR扩增区

42. 上机检测及结果分析,上机前混匀、离心反应体系

43. 按试剂盒说明书设置扩增参数并分析,并根据说明综合判读结果。

以上还只是核酸检测过程简单概括,真正操作起来不是三言两语就能做好的,德晟的病毒保存液也只是整个核酸检测体系中很小的一个环节。另外,还要提醒检测人员,检测时要保护好自己,穿好防护设备并且做好实验前后设备、防护用品、医用垃圾的消毒工作。

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