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α-葡萄糖苷酶在筛选活性天然药物中的应用

2020/12/28 13:30
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α-葡萄糖苷酶又称葡萄糖基转移酶(α-glucosidase,EC.3.2.1.20),系统命名为α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它在糖的催化反应中具有水解和转糖苷的双重作用。水解作用可从α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非还原性末端切开α-1,4糖苷键,释放出葡萄糖;转糖苷作用又可将游离出的葡萄糖残基以α-1,6糖苷键转移到另一个葡萄糖或麦芽糖类底物上,从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(简称IMO)。

 

 

20世纪80年代日本从黑曲霉中筛选出α-葡萄糖苷酶生产菌种,并得以工业化生产酶制剂以来,α-葡萄糖苷酶在基础研究和工业生产上发挥着越来越重要的作用。目前国外生产的α-葡萄糖苷酶大部分为纯酶,酶活较高;而国内主要以粗酶液为主,酶活较低。而且,国内尚未有商品化α-葡萄糖苷酶酶制剂出售,用于生产的酶均来自国外少数几个酶制剂厂,进口价格昂贵,导致IMO的生产成本居高不,一定程度上制约了我国IMO产业的发展。

α-葡萄糖苷酶能催化α-1.4-糖苷键水解,使小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解。抑制α-葡萄糖苷酶的活性,可使葡萄糖的生成及吸收减缓,降低餐后血糖峰值,调整血糖水平,在调节糖代谢的同时也调节了脂肪的生成。α-葡萄糖苷酶抑制药物成为近年来药物化学的研究热点。传统筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂方法是用游离的α-葡萄糖苷酶同时和它的底物(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG))以及和被筛选的抑制剂作用。

α-葡萄糖苷酶在筛选活性天然药物中的应用:

1、α-葡萄糖苷酶固定化:用三羟甲基磷为交联剂,以壳聚糖作载体固定化α-葡萄糖苷酶;

2、制作抑制剂筛选模型:将上述固定化Α-葡(萄)糖苷酶α-葡萄糖苷酶装入直径为0.8cm、长度为8cm的层析柱中,柱中加入pH6.8的磷酸钾缓冲液,于4℃保存,构成筛选模型;

3、模型有效性验证:用具有代表性的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖进行该筛选模型有效性验证,将上述柱子下端紧密插入带有活塞的小管,上端插入一注射器,将柱中的缓冲溶液压到离柱顶下约0.4cm后,分别加入50μl的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(0.116mol/L)和一定量的阿卡波糖溶液(250mg/L),轻轻震荡使柱顶的溶液混匀,然后继续压溶液至液面和柱顶相平,关上底端活塞,再把该柱放入水溶槽,在37℃下温育10分钟,待反应完毕,用5ml pH6.8磷酸钾缓冲液冲洗柱内,收集洗液,把洗脱液稀释至10ml体积,用紫外分光光度计在400nm处测定吸光度值;并把上述50μl的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖溶液和5ml缓冲溶液稀释至10ml作空白,按照所得反应液的吸光度数据计算抑制剂阿卡波糖的抑制率;

4、抑制率I(%)的计算:I(%)=(ΔAE-ΔA)/ΔAE×100%,ΔAE=未加抑制剂前固定α-葡萄糖苷酶与4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷反应后的吸光度值(扣除相应空白);ΔA=加入抑制剂后固定化α-葡萄糖苷酶与4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷反应后的吸光度值(扣除相应空白);C为抑制剂浓度,C为横坐标,抑制率I%为纵坐标,作抑制剂浓度C与相应抑制率I%的回归曲线,并于50%抑制率处得到半抑制率浓度IC50。

5、用固定化α-葡萄糖苷酶筛选模型进行中药虎仗水溶性部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选,筛选虎仗水溶性部位。

德晟生产多种酶制剂产品,提供的酶制剂产品主要作为试剂盒检测原料,除了α-葡萄糖苷酶,还有葡萄糖脱氢酶和葡萄糖氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、嘌呤核苷磷酸化酶、乳酸脱氢酶等。有需要的朋友可咨询我们,可为客户提供样品。

 

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