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德晟关于神经氨酸苷酶的纯化方法介绍

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德晟关于神经氨酸苷酶的纯化方法介绍

2020/12/28 17:05
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神经氨酸苷酶是乙酰-神经氨酸水解酶(唾液酸酶)的俗称。它的pH稳定性4.0~9.5比活性:≥400U/mg该酶可以催化水解糖蛋白和寡糖的 α2-3、α2-6 和 α2-8键连接的 N-乙酰神经氨酸残基,下面由德晟科技为您介绍神经氨酸苷酶纯化方法,这种纯化方法包括以下操作步骤

 

 

(1) 超滤浓缩:景取产脲节杆崗的发酵液h淸1〜20U进行膜超滤,用缓冲液A对超滤后的浓缩液进行稀释至0..5〜10L ;

(2)硫酸铵沉淀:缓慢加入226〜516g硫酸钱,搅拌20〜4()m1ndW 1〜5h,5000〜15000g离心10〜30m1n,去上清,沉淀用缓冲液B溶解到100〜1000ml,搅拌充分后透析过夜;

(3) DEAE琼脂糖凝胶FF柱层析:1)RAE琼脂糖凝胶FF柱用缓冲液B平衡后,将透析后样品进行h样,缓冲液B平衡,缓冲液C洗脱,收集洗脱样品;

⑷苯基琼脂糖凝胶FF柱层析:往收粜的洗脱样品屮加入(NH 4 ) 2 S0 4 使终浓度达到0. 6〜().8M,然后苯基琼脂糖凝胶FF柱用缓冲液丨)平衡,将加入/ (NH 4 ) 2 S0 4 的洗脱样品进行上样,缓冲液丨)平衡,缓冲液E洗涤,缓冲液F洗脱;

将步骤(4)得到的洗脱样品进行超滤浓缩后用缓冲液B进行换液,然后冻干,以操作均在05°C条件下进行;以上缓冲液A、B、C、1)、E、F分别

缓冲液 A :10 〜100mM Tr1s-HCL, 100 〜500mM NaCLpH6. 5 〜8. 5 ;

缓冲液 B : 10 〜100mM Tr1 s-HCl,pH6. 5 〜8. 5 ;

缓冲液 C :10 〜100mM Tr1s-HCL10 〜1000mM NaCl,PH6. 5 〜8. 5;

缓冲液 D :10 〜l00mM Tr1s_HCl,0.7 〜0. 9M(NH4 )2 SO4 , PH6. 5 〜8. 5;

缓冲液 E :10 〜l00mM Tr1s_HCl,0.4 0. 6M(NH4 )2 SO4 , PH6. 5 〜8. 5;

缓冲液 F:10100mM Tr1s-HCl,0.2 0.4M(NH4 )2 SO4 , PH6.5 〜8. 5 ;

以上就是德晟介绍的神经氨酸苷酶的纯化方法,它包括超滤浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE琼脂糖凝胶FF柱层析、苯基琼脂糖凝胶FF柱层析、换液冻干等步骤。以上操作均在05°C条件下进行。用该方法纯化得到的神经氨酸苷酶纯度高、底物特异性结合能力高,用该方法得到的神经氨酸苷酶来检测人体血清屮唾液酸含量,精确度更高。

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