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吖啶酯标记核酸DNA的方法

2021/03/04 13:30
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化学发光试剂吖啶酯CLIA中重要的检测试剂,外观成黄色粉末,它的检测灵敏度非常高,逐渐成为国内体外诊断领域主流的检测手段。能被吖啶酯检测标记的对象包括蛋白质、抗体、核酸DNARNA等,适应范围广。

在体外诊断方面,吖啶酯化学发光试剂很适合于标记DNA链以制造化学发光DNA探针,本文将介绍一种吖啶酯标记核酸的方法。

化学发光试剂吖啶酯

核酸是所有生物分子中最重要的物质,广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内,核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类。现代医学研究成果表明,许多疾病如癌症和遗传疾病的发生都与DNA的突变有关,且许多传染性疾病是由环境中的病毒、病菌或寄生虫引起的,因此,对病毒特定序列DNA的分析有利于疫情的控制。

在核酸杂交分析中,制备特异性强、灵敏度高的标记探针是核酸杂交分析成功的关键,吖啶酯衍生物可以直接标记在核酸探针上,不需催化剂且发光量子产率不受影响;另外,在一定条件下,未杂交的单链DNA上标记的吖啶酯被水解破坏,只有杂交形成的双链保护的吖啶酯才能产生化学发光,不需分离即可监测整个杂交过程。

这种吖啶酯标记核酸的方法,主要包括3个步骤,首先分别对DNA探针5’端、3’端进行保护;然后进行吖啶酯标记,最后HPLC纯化分离DNA。其中吖啶酯标记最为关键,将25mM 吖啶酯溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,配置1M HEPES缓冲液(PH8.0),按照摩尔比核酸探针:吖啶酯=1:5的条件,加入到HEPES缓冲液中,37℃温度下反应1h

这种方法创造性的在DNA两端都标记了吖啶酯,进一步提升了检测的灵敏度。吖啶酯具有反应条件温和、重现性好、发光效率高、发光强度强等优点,广泛应用于无机有机化合物、环境监测、生物及药物分析等领域,另外也普遍用于多种类型疾病的灵敏检测和诊断。

吖啶酯化学发光试剂包含吖啶酯与吖啶磺酰胺两种类型,德晟研发的共有六种吖啶酯试剂,可满足标记蛋白质、抗体、核酸等分子的不同需求。

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Tris(三羟甲基氨基甲烷)是一种常见的生物缓冲液,可用于整个DNA提取过程。从多种来源提取过程中,DNA对pH敏感。在细胞裂解,去除不需要的细胞成分和沉淀过程中,可以使用tris来维持稳定的pH值。另外,它在细胞裂解中也起到特别重要的作用。
生物缓冲剂是电泳技术的重要组成部分,一般将其添加到溶液当中,以在电流通过样品时使pH稳定。此外,缓冲剂还能提供电泳迁移时所需的离子。
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