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发光标记物吖啶酯(NSP-SA-NHS)如何标记抗体

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发光标记物吖啶酯(NSP-SA-NHS)如何标记抗体

2021/03/10 13:30
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吖啶酯(NSP-SA-NHSCas199293-83-9及其相关化合物已被证明是非常有优势的化学发光标记物,其稳定性、活性和敏感性超过了某些放射性同位素。吖啶酯能与含有一级氨基的蛋白发生反应。在碱性条件下,NHS作为离去基团被取代,蛋白质与吖啶酯形成稳定的酰胺键。反应完成后,多余的吖啶盐通过脱盐柱除去,下面介绍下NSP-SA-NHS使用说明(举例抗体/蛋白质标记)

1.配制   

标记缓冲液:0.2M NaHCO3  (pH=9.0)

标记终止缓冲液:10% 赖氨酸  0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液;

脱盐纯化缓冲液:0.1M Na2HPO4-NaH2PO4  (pH=6.5)

吖啶酯发光液:(0.01~0.1M) NaOH+0.05% H2O2

2. 计算标记所用抗体(蛋白质)和吖啶酯的量:

通常设定摩尔比n(抗体): n(吖啶酯)=1:10~1:50,具体需根据氨基酸组分进行摸索调整;

配制2.5mg/ml 吖啶酯-DMSO母液,注意玻璃器皿盛放并避光;

使用0.2M NaHCO3pH=9.0 溶液配制0.1~0.5 mg/ml 抗体反应液 

3. 连接及纯化

本说明书举例针对标记抗体抗体的分子量为 180kd 对应 15 倍的吖啶酯。如果用户的待标记样品是其他的分子量,请参考附表 1 改变试剂的配比。

1.取 10 µL 稀释吖啶酯母液 (2.5mg/ml),加入 90 µL 无水 DMSO(or DMF) 稀释10倍,配成吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)

2.使用0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液稀释 50µg 的抗体至 300 µL,加入 10 µL吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)(参考附表 1)。

3.锡箔纸包好,室温标记0.5~1h

4.淬灭反应,加入 100 µL 标记终止缓冲液,室温混匀 30 分钟(注:如果标记较充分,也可以跳过此步骤,直接进行柱纯化)。

5.  脱盐柱纯化,收集吖啶标记蛋白组分并检测浓度,请参考说明书后文。

6.  检测标记的蛋白,取10µL吖啶标记蛋白,放于黑色96孔板中,向每个微孔注入 50 µL~150µL吖啶酯发光液,立即检测,如果发光过强,可以对标记蛋白再进行若干倍的稀释,使其在仪器的发光检测限内。注:吖啶酯发光液最好现用现配,或者将NaOH溶液和过氧化氢溶液分别配成2x母液,使用的时候再11进行混合。

7.  吖啶酯标记的蛋白可以在酸性缓冲液中4℃避光存储(注意补加叠氮钠等防腐剂),如果储存效果不佳,则请避光保存于-20℃或者-80℃

德晟是国内专门生产吖啶酯的厂家,质量和产量都受到好评。德晟研发生产的一共有6种不同基团的吖啶酯产品,包括:NSP-DMAE-NHSDMAE-NHSNSP-SANSP-SA-NHSME-DMAE-NHSNSP-SA-ADH,品质非常可靠,客户满意度很高,欢迎前来选购。

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