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TOPS测定游离脂肪酸的方法优化

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TOPS测定游离脂肪酸的方法优化

2021/04/06 17:05
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血清或血浆中的游离脂肪酸测定通常采用Trinder色原酶光度法,不过由于该检测的特点,脂肪酸的检测受影响的因素较多,需要在检测方法上加以优化改良,提高检测的准确率。

Trinder色原检测FFA原理:

该检测方法有三个反应步骤:游离脂肪酸(FFANEFA)在乙酰辅酶ACoA)合成酶(ACS)的作用下与过量CoA生成酰基辅酶A,在乙酰CoA氧化酶(ACO)作用下与氧气反应生成23-反式-烯酰基CoA和过氧化氢,利用Trinder反应检测过氧化氢,即可得出FFA的含量。

FFA测定色原建议用TOPS

FFA测定存在的问题及优化方法:

1.反应过量的辅酶A会干扰过氧化氢与Trinder色原反应,使整个检测结果偏低,可以用N-乙基马来酰亚胺(NEM)去除多余的辅酶ANEM稳定性非常受限,只有一个星期。

2.所采用的乙酰CoA合成酶与乙酰CoA氧化酶对不同游离脂肪酸的底物特异性不同造成测定结果之间有差异,酶来源不同对不同C链长度的游离脂肪酸的底物特异性不同,即反应能力大小不同。人血清中载有6FFA,只有对它们反应特异性都高的酶,才能使测定结果无差异。

3.由于CoA对反应造成的影响,使数据结果线性范围窄,市面上测定FFA的色原有MEHATBHBTOOS等,但受CoA的干扰较大,而它又必须过量,所以需要采用干扰少的色原。SCEP不受辅酶A干扰但不稳定,ADOSTOPSCoA干扰小,而TOPS摩尔吸光系数更大,因此它是更优的色原底物。

4.加入巯基复合物DTNBMIT,减少NEM用量,DTNM的巯基可与CoA的巯基反应从而去除对色原干扰,少量MIT可去除CoA的巯基,同时也起到防腐剂的作用。在采用TOPS色原的基础上,能完全消除CoA的干扰,稳定性大大提高。

如果对FFA测定结果要求较高,可以根据上述几点选择更优质的试剂盒。德晟生产的是FFA及其它指标测定的试剂盒原料,若是直接用TOPS测定FFA,因溶液稳定性差,建议临用时配成工作液现配现用。

 

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