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肌氨酸氧化酶SOX的纯化

2021/04/16 17:05
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肌氨酸氧化酶简称SOX,是肌肉代谢产物肌酐的代谢过程中一种重要的酶,生化检测中它被用于检测肌酐的含量,其酶活直接影响检测结果准确性,检测中需采用纯化后的SOX。

肌氨酸氧化酶基因工程制备纯化

肌氨酸氧化酶法测定肌酐:

肌氨酸氧化酶与肌酐酶、肌酸酶CRH耦联催化使肌酐最终降解成为甘氨酸与过氧化氢,以此为基础可以进行肌酐的测定。血液、尿液中肌酐的含量是判断肾功能是否正常的一个重要指标,通常采用肌氨酸氧化酶法测定肌酐:以色原底物TOPS通过Trinder反应测量肌酐经SOX催化后生成的过氧化氢,显色产物的量由吸光度测得,吸光度与肌酐含量成正比。

所用的肌氨酸氧化酶由基因工程制备并进行纯化:

  1. 将来源于芽孢杆菌Bacillussp.的肌氨酸氧化酶(SOX)基因克隆并转化至大肠杆菌E.coli表达,经IPTC试剂诱导后,收集E.coli湿菌体后采用20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl缓冲液(pH8.0)清洗后上离心机离心
  2. 离心完成后,去除上清液然后重新将菌体悬浮于20mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中超声波破碎。破壁条件为4min/1min(超声时间/间歇时间)破壁时间为20min至溶液变澄清即获得肌氨酸氧化酶的粗酶液。
  3. 采用琼脂糖sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸亲和层析纯化肌氨酸氧化酶,20mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡亲和层析柱再将粗酶液进样层析柱采用0.03mo1/L NaC1/ 20mmo1/L Tris-HC1缓冲液(pH8.0)洗脱目的蛋白质

纯化后的肌氨酸氧化酶SDS-PAGE分析在相对分子质量43kDa处有明显单一蛋白质条带。经sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸亲和纯化粗酶液中杂蛋白质基本除去纯化的SOX达到电泳纯比酶活为30.8U/mg酶活回收率91.2%。采用MALDI-T0F对SOX相对分子质量进行鉴定该重组蛋白质相对分子质量43.8kDa与来源Bacillus sp.B-0618的SOX(相对非常质量43839Da),纯化后的样品置于4℃保存备用。

肌氨酸氧化酶纯化过程中有多种试剂和仪器,德晟作为ivd原料厂家,可提供的有SOX酶制剂、Tris缓冲剂以及测定肌酐所需的色原底物TOPS。

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