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胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

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胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

2021/05/09 17:05
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同型半胱氨酸(HomocysteineHcy)又称高半胱氨酸是一种含巯基的氨基酸是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物.研究表明Hcy是导致心脑血管疾病糖尿病以及神经系统疾病的危险因素因此快速准确检测Hcy含量方法的建立对基础研究和临床诊断都有非常重要的意义

胱硫醚β-裂解酶CBL)测定Hcy的原理

本实验室拟建立一种通过酶催化测定Hcy的方法该方法具有快速方便灵敏精确的特点.反应原理如下:HcyL-丝氨酸在胱硫醚合酶(CBS)催化下生成L-胱硫醚L-胱硫醚又经过胱硫醚β裂解酶(CBL)催化生成丙酮酸丙酮酸在碱性条件下与24-硝基苯肼反应生成棕红色产物利用分光光度计在520nm下测定吸光度值即可得到丙酮酸含量从而计算出样品中Hcy的浓度.下面我们来看看CBL的酶学性质考察

胱硫醚β-裂解酶CBL的分离纯化

菌体超声破碎后的上清液离心后上样到预平衡的HisTrapFastFlow目的蛋白直接吸附到柱上用洗脱缓冲溶液进行洗脱一步纯化得到CBL酶活性回收率为71%纯化的CBL纯度达到949/6单位酶活为134.6U.mg,研究发现纯化后的CBL蛋白溶液经冻融后几乎全部聚集沉淀,这可能是由于蛋白质溶液冻融时产生的冰晶影响了蛋白质的三级结构所致。

CBL在不同温度下的酶活稳定性

CBL2O35℃下较稳定随着温度的升高稳定性逐渐下降超过40℃时酶失活速度加快当温度升至50℃时相对酶活下降至32.2%.因此35℃下使用CBL酶催化反应最有效且不宜将酶液长期放置在30℃以上环境发酵得到的CBL40℃以下较稳定,从乳酸乳球菌(LactoCOCCUSlactis)中纯化的CBL6O℃以下比较稳定,60℃以上酶活性急剧下降,70℃时几乎完全失活。

CBL最适pH值及pH值稳定性

重组酶在碱性条件下(pH8.01O.O)活性较高,在pH8.0的条件下反应活性最高,在酸性溶液中(pH<7.0)活性较低,在pH5.0的条件下活性几乎为零,在pH5.O5.5之间只有1O15%的活性,在pH7.58.5之间反应活性最高,在pH>8.5时活性急剧下降。

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