煲汤大师如何用好蛋白纯化缓冲液

发布时间:

2021-08-04


一个好的蛋白纯化大师肯定定可以成为一个煲汤大师,也只有汤做的好,电泳才能做的好,原理差不多是类似的。煲汤也好,蛋白纯化也好,都要对火候、蛋白质的耐热性、缓冲液的特性了解充分。

通常来说蛋白质的耐热性能和其一级结构的稳定性(肽键的稳定性)关系不大,更多的是在高温下,高级结构破坏疏水部分暴露以后,蛋白聚集沉淀。比如一个鸡蛋,就算做成鸡蛋花汤,如果用SDS上样缓冲液溶解,蛋白大部分还是会保留以一级结构的稳定性。

不过上述说话不绝对,比如煲汤的时候,只要时间到位了,汤就可以变鲜美,这实际上就是蛋白质多肽链的水解,释放出氨基酸以及一些小分子使味道变鲜美。也就是说,只要煲汤或加热的时间足够,蛋白质的肽链终会被打断,温度越高降解越快。

蛋白缓冲液成分和作用

为了提高蛋白的稳定性,蛋白缓冲液中会添加许多成分,比如Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸)或Tris甘氨酸、与EDTA盐(乙二胺四乙酸二钠),还需添加SDSDTT(二硫苏糖醇)等等。DTT作为还原剂可以保护蛋白的肽键,通常肽键比二硫键稳定,无还原剂时,50度、80度、100度煮样5分钟,都可以造成部分二硫键的打开,温度越高打开的越多。可见在100度的非还原加样缓冲液中,二硫键打开速度慢,肽键断裂也就更慢了。

缓冲液中添加的还原剂如果太差,会出现还原剂和蛋白之间发生再次交联,也就是已经寡聚的还原剂和蛋白质上的巯基再次交联在一起,此时的交联是非特异的,条带就会变糊。所以酶或者要求高的蛋白缓冲液中用TCEP作还原剂。

Tris甘氨酸作缓冲液时,有些实验室会重复回收使用甘氨酸running buffer,其实没有必要。通常电泳用的甘氨酸质量已经不太好,杂质太多,在电泳胶的上端压缩胶中的时候就有问题,进入分离胶就会出现离子对不平衡,扩散的厉害。

许多实验室SDS电泳处理样品时100度煮3-5分钟,加热对蛋白肽键影响不大,不过TrispH受温度影响也是要注意的。德晟是生物缓冲剂厂家,可提供优质的TrisMOPS等缓冲剂原料。

 

三羟甲基氨基甲烷盐酸,生物缓冲剂