选择生物缓冲液时您必须考虑的五大因素

发布时间:

2022-06-06


随着蛋白质化学和分子生物学的发展,用于各种疾病治疗的蛋白质类药物的研制和应用已成为生物医药产业发展的热点。多肽和蛋白类药物副作用小、活性强,并具有标本兼治的功效。当我们纯化蛋白时,要保持蛋白在纯化过程中不能失活,或者是尽量降低纯化过程对蛋白活性带来的损失。因此,在设计缓冲液时应考虑以下几个因素:pH值、缓冲体系、盐离子、还原剂和稳定剂。

pH

很多实验的pH值设定在7.4以模仿生物条件,但如果目的蛋白在此条件下不稳定,就需要改变pH值使它在溶液中处于可溶且不会降解的状态。当溶液pH值在蛋白等电点pI附近时,其在溶液中会表现得不易溶解,因为此时蛋白表面没有净电荷,从而容易聚集。可以用ExPASy网站的ProtParam工具快速简便地计算蛋白等电点pI值,只要提交蛋白序列即可。

缓冲体系

首先我们要确保所选择的缓冲体系在设定的pH值上确实具有缓冲能力,其解离常数pKa值应该在所设定的pH值上下一个单位内。

再者是确保缓冲液浓度足够高以达到实际缓冲溶液的作用。一般会选择的浓度是20~100mM。需要注意的是所使用的缓冲体系不能影响蛋白活性,比如磷酸盐会抑制激酶的活性,所以反应前应彻底地透析掉。

此外,一些缓冲体系对温度非常敏感,例如Tris-HCl缓冲液,如果在25℃时将缓冲体系调至pH8,其pH值将在5℃时增加到8.58,在37℃时降到7.71,所以,如果不是在25℃下进行实验,就应该考虑到这个pH值可能在实验条件中不适用。

盐离子

许多缓冲液中含有NaCl,以帮助保持蛋白的可溶性和模拟生理条件,浓度一般为150mM,但在不同的蛋白纯化步骤中,可能需要不同的盐离子浓度。离子交换层析一般是低盐结合、高盐洗脱,结合时需要降低盐浓度是为了避免高离子强度下,盐离子与蛋白竞争与填料结合,防止蛋白从离子交换柱中流穿,从而使柱子能够结合目的蛋白;而疏水层析一般为高盐结合、低盐洗脱。

还原剂

如果目标蛋白含有半胱氨酸残基,可能会出现残基间的氧化问题,并可能导致蛋白聚集。为了防止这一点,往往会在缓冲液中添加一些还原剂,如DTTTCEP和巯基乙醇。

TCEP是这三个还原剂中较稳定的,但是价格也是较贵的。通常纯化过程中的缓冲液里会添加DTT,在保存酶液的缓冲液里添加TCEP。还原剂浓度一般是5~10mM,它应远远高于蛋白浓度。DTT和巯基乙醇在室温下就会降解,所以需要将添加了还原剂的缓冲液处于低温保藏,或者在使用时再添加还原剂。

使用还原剂时要确保柱材料能够与之相容,比如高浓度的还原剂会脱掉镍柱中的镍,并使柱子颜色变深呈棕色,虽然镍柱能进行再生,但柱载量将会受到很大影响。

稳定剂

添加一些稳定剂到缓冲液中,能帮助提高蛋白纯化时的蛋白溶解度和稳定性。在缓冲液中添加惰性蛋白BSA在某种程度上可以稳定目标蛋白,但必须确保这些加入的稳定剂不干扰实验;有时添加甘油、聚乙二醇等以增加缓冲液粘度,有助于防止蛋白聚集;另外,使用少量的表面活性剂和一些离子化合物如硫酸盐、氨基酸、柠檬酸等可以避免蛋白间的离子相互作用,帮助蛋白溶解。

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