了解TRIS-HCL等缓冲液的使用和制备-快速完成WB实验

发布时间:

2022-09-17


蛋白质的溶解和稳定

WB时要保证电泳成功,破坏蛋白质之间的聚集作用就先要做。比较理想的情况是:细胞裂解和蛋白的溶解都在电泳样品缓冲液中进行。如果没有办法做到这点,就要在增溶溶液中制备蛋白,该溶液包含除垢剂、变性剂/还原剂,以及兼容电泳的缓冲液。其中裂解缓冲液包含不同的除垢剂,可以帮助破坏细胞并释放蛋白,使它们溶于溶液。但是,不同种类的蛋白质与缓冲液和除垢剂的反应是有所不同的

很长时间制备的细胞提取液检测不到目的蛋白WB实验好不容易做完了结果发现条带很弱或没有条带,这是科科研人的WB现状,道理都懂但却状况百出。假如遇到目标蛋白在溶液中不溶解,或者蛋白-蛋白相互作用比较特殊,则需要尝试使用其他特殊缓冲液,并交换去除除垢剂。那么在进行 WB 时关于缓冲液、还原剂的选择和使用以及有哪些原则可以遵循?

缓冲液使用的一般原则

蛋白质种类

常用的缓冲剂

注意事项

全细胞裂解物和膜结合蛋白

RIPA 、NP-40

RIPA 缓冲液的强力特性适合难溶蛋白

/线粒体蛋白

RIPA

通常先使用分级分离方案来增加特定细胞器及目标蛋白的浓度。

细胞质蛋白

Tris-HCl 、RIPA (Tris-HCl 有时优势更大

需要根据实验确定条件,以获取更多的目标蛋白。

天然状态蛋白质

CHAPS(两性离子除垢剂,能更好保护蛋白的天然状态)

常用于等电聚焦 IEF) 和 2-D 电泳。

 

 

常用裂解缓冲液配方

为帮助大家进行 WB 实验时更好的了解缓冲液的使用原则,这里也给到了一些常用的缓冲液配方以及常用的还原剂种类裂解缓冲液配方如下所示:

Tris-HCI配方:20mM Tris-HCl, pH7.5

CHAPS配方: 150mM KCI 50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)0.1%CHAPS3-3-胆酰胺丙基二甲氨基-丙磺酸内盐

RIPA配方: 150mM NaCI1%NP-40 or Triton X-100 0.5% sodium deoxycholate  0.1%SDS 50mM TrispH8.0

NP-40配方:150mM NaCI1%NP-40or Triton X-10050mM TrispH8.0

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Tris-HCI