TRIS缓冲液在琼脂糖电泳提取质粒中的应用

发布时间:

2020-06-14


Tris(三羟甲基氨基甲烷)为弱碱,在室温25℃下,它的pKa为8.1,有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右,一般加入盐酸以调节pH值所需值,即可获得该pH值的缓冲液。由于Tris缓冲液为弱碱性溶液,DNA在这样的溶液中会被去质子化,从而提高其溶解性。如果将调节pH值的酸溶液换成乙酸,则获得“TAE缓冲液”(Tris/Acetate/EDTA),而换成硼酸则获得“TBE缓冲液”(Tris/Borate/EDTA)。这两种缓冲液通常用于核酸电泳实验中。由Tris配成的TAE,TBE等是DNA电泳常用的试剂,TE(pH8.0)主要用于溶解DNA。(TE为Tris加EDTA合称。)1MTris-HCl6.8和1.5MTris-HCl8.8是SDS-PAGE常用的试剂。

在基因工程的常规操作中,琼脂糖凝胶电泳应用广泛。琼脂糖凝胶电泳是分离,鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。它通常采用水平电泳装置,在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液(一般为碱性)中带负电荷,在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小,构象。电场强度和方向,碱基组成,温度和嵌入染料等因素的影响。

操作步骤:

① TE 缓冲液( 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA )

电泳缓冲液( 50XTAE )

②  电泳缓冲液( 50XTAE )Tris 242g, 冰醋酸 57.1ml,EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml

使用时用蒸馏水稀释 50 倍。

③ 样品缓冲液( 6X ) 0.25% 溴酚蓝, 0.25% 二甲苯青, 40% ( W/V )蔗糖

④ STET 缓冲液( pH8.0 )( 8% 蔗糖, 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris )

1) 量取 100毫升TAE电泳液,加入0.7克琼脂糖,混匀后,置于微波炉中,加热
3分钟,充分溶解琼脂糖。 

2) 用灭菌后的橡皮胶,封闭清洁干燥的电泳板,并用少量的琼脂糖液封边。安放梳子,调整梳子的底部边缘与电泳板之间的距离,一般以 1-2毫米为宜。

3) 当溶解后的琼脂糖液冷却至500 C左右时,加入溴化乙锭5 m l ,溴化乙锭的最终浓度为1.0 m g/ml . 混匀后,将琼脂糖液倒入电泳板中,静止,切勿移动。

4) 在凝胶完全凝固后(于室温放置 30-45分钟),轻轻地取出梳子,除去胶带,将凝胶放入电泳漕中。

5) 电泳漕中,加入电泳液( 1 ′ TAE),使电泳液覆盖在琼脂糖胶面之上约1-2毫米。

6) 取质粒提取液(酶切),加入 1/5样品缓冲液,充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中,分别加入DNA分子量标记物( marker ),对照以及质粒提取液(酶切)样品

7) 接通电源,在 90V下,电泳1小时,当溴酚兰颜料迁移凝胶前沿时,切断电源。

8) 取出凝胶,在紫外灯下,观察 DNA的迁移位置

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