新闻中心

全部分类

首页

发光标记物吖啶酯（NSP-SA-NHS）如何标记抗体

发布时间：

2021-03-10

吖啶酯（NSP-SA-NHS），Cas199293-83-9及其相关化合物已被证明是非常有优势的化学发光标记物，其稳定性、活性和敏感性超过了某些放射性同位素。吖啶酯能与含有一级氨基的蛋白发生反应。在碱性条件下，NHS作为离去基团被取代，蛋白质与吖啶酯形成稳定的酰胺键。反应完成后，多余的吖啶盐通过脱盐柱除去，下面介绍下NSP-SA-NHS使用说明（举例抗体/蛋白质标记）。

1.配制

标记缓冲液：0.2M NaHCO3 (pH=9.0)；

标记终止缓冲液：10% 赖氨酸 0.2M NaHCO3 (pH=9.0)溶液；

脱盐纯化缓冲液：0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 (pH=6.5)；

吖啶酯发光液：(0.01~0.1M) NaOH+0.05% H2O2 。

2. 计算标记所用抗体（蛋白质）和吖啶酯的量：

通常设定摩尔比n(抗体): n(吖啶酯)=1:10~1:50，具体需根据氨基酸组分进行摸索调整；

配制2.5mg/ml 吖啶酯-DMSO母液，注意玻璃器皿盛放并避光；

使用0.2M NaHCO3（pH=9.0）溶液配制0.1~0.5 mg/ml 抗体反应液。

3. 连接及纯化

本说明书举例针对标记抗体抗体的分子量为 180kd 对应 15 倍的吖啶酯。

1．取 10 µL 稀释吖啶酯母液 (2.5mg/ml)，加入 90 µL 无水 DMSO(or DMF) 稀释10倍，配成吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)。

2．使用0.2M NaHCO3 (pH=9.0)溶液稀释 50µg 的抗体至 300 µL，加入 10 µL吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)。

3．锡箔纸包好，室温标记0.5~1h。

4．淬灭反应，加入 100 µL 标记终止缓冲液，室温混匀 30 分钟（注：如果标记较充分，也可以跳过此步骤，直接进行柱纯化）。

5. 脱盐柱纯化，收集吖啶标记蛋白组分并检测浓度，请参考说明书后文。

6. 检测标记的蛋白，取10µL吖啶标记蛋白，放于黑色96孔板中，向每个微孔注入 50 µL~150µL吖啶酯发光液，立即检测，如果发光过强，可以对标记蛋白再进行若干倍的稀释，使其在仪器的发光检测限内。注：吖啶酯发光液最好现用现配，或者将NaOH溶液和过氧化氢溶液分别配成2x母液，使用的时候再1：1进行混合。