一文解决蛋白酶K遇到的这些问题
发布时间：
2021-09-06
1.什么是蛋白酶K？
蛋白酶K是一种内肽酶，属于丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶组。在分子生物学实验室中，蛋白酶K通过降解和灭活蛋白质在DNA或RNA样品的制备过程中很有用。
2.蛋白酶K活化的合适温度是多少？
蛋白酶K活性随温度升高（达到某个点）。合适温度范围在50-65˚C之间。较高的温度有助于蛋白质解折叠，从而降低蛋白酶K分解这些蛋白质的能力。
3.蛋白酶K如何参与细胞裂解？
当涉及细胞裂解时，尤其是下游DNA分离和纯化时，蛋白酶K可以通过消化表面蛋白成为裂解步骤的一部分。进一步进入该程序，当需要在含有蛋白酶K的缓冲液中重悬和裂解细胞核时，蛋白酶K将帮助消化否则会降解样品的蛋白质。
4.蛋白酶K如何用于哺乳动物DNA分离？
从哺乳动物细胞和白细胞中分离DNA的第一步是裂解细胞并将其旋转以收集沉淀。悬浮后，加入去污剂(SDS)以破坏核膜。蛋白酶K消化蛋白质后，组蛋白和非组蛋白都会释放DNA。此外，蛋白酶K会消化溶液中的核糖核酸酶并使其失活。
5.蛋白酶K可以用于RNA分离吗？
在RNA分离过程中，蛋白酶K的加入会在底物存在的情况下降解和灭活甚至微量的核糖核酸酶。额外的苯酚氯仿和异丙醇沉淀步骤减少了蛋白质污染，并使最终的沉淀更容易重新溶解。
6.蛋白酶K与钙的关系究竟是什么？
蛋白酶K与两个Ca2+离子结合，这有助于保持酶的稳定性，尤其是在温度升高时。钙还可以保护蛋白酶K免于自溶。虽然钙有助于维持蛋白酶K的热稳定性，但它不是蛋白水解活性所必需的。
7.EDTA会灭活蛋白酶K吗？
螯合剂如EDTA或EGTA对蛋白酶K的酶活性没有直接影响。在DNA或RNA纯化过程中使用EDTA和蛋白酶K的原因是为了去除钙。但由于钙与蛋白酶K的稳定性有关，添加EDTA会对钙产生影响，从而在一定程度上降低蛋白酶K的活性。
蛋白酶K
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