了解完TAE和TBE,就知道你的电泳白跑的原因了

发布时间:

2021-11-24


跑了这么多年的电泳,你知道它的原理吗?很多人肯定不知道,因为它太基础了,就是刚进实验室的时候,我也没问琼脂糖凝胶电泳的原理,而师兄也只讲了DNA带负电,会往正极跑;EB嵌入到DNA链中,通过紫外照射就能看见了。其余的就不了解了。

凝胶电泳的原理

DNA分子在常规的电泳缓冲液(高于等电点的pH溶液)中5’磷酸的氢离子因解离而被中和,只剩磷酸根离子,故带负电,因而在电场中向正极移动。又由于琼脂糖凝胶具有分子筛效应,在一定的电场强度下,由于待分离样品中的各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使不同DNA分子产生不同的的迁移速度。因此琼脂糖凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA,也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子,如质粒的三种构型。下面来说一下TAETBE.

TAE

TAETris-乙酸,是使用较广泛的缓冲液。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量,且双链线状DNA在其中的迁移率较其他缓冲液快约10%DNA片段大于13kb时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果,此外,DNA片段回收时用TAE缓冲液进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小,长时间电泳发热大,除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。

应用:大片段核酸分子分离,琼脂糖凝胶电泳DNA的回收,酶切检测,PCR反应。

50x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA)配置如下

242 g ----------- Tris base

57.1 ml ----------- Acetic acid

100ml ------------ 0.5M EDTA

Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5

TBE

TBETris-硼酸,缓冲容量大,但是溶解度小,不易长期储存,易产生沉淀。其对小于1kb的片段分离效果较好,但因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低,而且硼酸盐 离子有可能影响后续的酶促反应,因此需要切胶回收的实验一般不推荐TBE电泳。

 对于一般的仅做检测的电泳常用此缓冲液,如DNA、质粒、RNA提取后的检测。因为TBE跑出来的胶分辨率会比较高。

常配制成10×的母液,可以放置较长时间而不形成沉淀,使用时稀释至0.5×

10x TBE Buffer (Tris-Borate-EDTA)配置如下

108 g--------------- Tris base

55 g --------------- Boric acid

9.3 g --------------- Na4EDTA

Add ddH2O to 1 liter.

The pH is 8.3 and requires no adjustment.

RNA甲醛变性胶

提取样品的总RNA后,一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构,因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳,得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。

5X甲醛凝胶电泳缓冲液

0.1mol/L MOPS(PH7.0) 

40mmol/L 乙酸钠

 5mmol/L EDTA(ph8.0)

 电泳前先将RNA65℃加热处理5 min,并冰上骤冷,以减少RNA的二级结构。建议上样前在RNA样品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙锭(EB,浓度1.0 mg/mL),而不在胶中加EB,这样电泳后的背景较低。

琼脂糖凝胶电泳,TAE,Tris-乙酸