三(羟甲基)氨基甲烷Tris饱和酚的配制

发布时间:

2020-08-05


Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)作为一种常用的生物缓冲剂在生物化工领域有着广泛的应用,比如核酸纯化,而饱和酚在核酸纯化中有2种,一种为Tris饱和酚,故也称为碱性酚、Tris平衡酚(Tris saturated phenol或Tris balanced phenol),是用Tris-Cl pH8.0饱和过的重蒸酚,为浅黄色透明液体,有刺激性气味,上层为Tris盐酸缓冲液,溶液内加有抗氧化的8-羟基喹啉。适用于从核酸样品中去除蛋白质,提取DNA等。另一种就是酸性酚,也就是水饱和酚,用于提取RNA。

  

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Tris饱和酚一般PH大于7.8,其中,酚是强的蛋白变性剂,可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。 而Tris的主要作用是防治止酚类氧化,若酚类氧化,则会形成醌(两个苯环),醌含有强自由基,会破坏核酸结构。同时,由于PH值大于7,在碱性环境中DNA处于水相,RNA处于有机相。从而分离上清,即可得到DNA。 

市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,为Tris饱和酚(pH7.8左右)。

Tris饱和酚的配置: 

1.冰箱取出重蒸酚,室温放置到68度水浴溶化,切勿立即放入68度的水浴中,以防玻璃炸裂 

2.加8-羟基喹啉到0.1%和β-巯基乙醇到0.2%,(原液14. 4MOL/ML),混匀,溶液呈现黄色,倒入分液漏斗中(也可在烧杯中进行) 

3.加入等溶剂的1MOL/ML的Tris(PH8.0),反复混匀后,静至分层;放出下层黄色酚液,弃上层 

4.加固体Tris约1g/100ml酚,摇匀,去水相

5.加0.1MOL/MLTris(PH8.0)平衡数次,至PH为8.0 

6.加0.1MOL/MLTris(PH8.0)于棕色瓶中,4度保存 

7.如黄色消失或呈粉红色(说明酚已经被氧化),则不能使用

注:重蒸酚为白色针状结晶体,有较强的腐蚀性,应尽量避免皮肤接触或吸入体内。如发现变为红色或棕色,表明发生氧化,不能使用。保存要求:-20℃,避光保存。三(羟甲基)氨基甲烷Tris饱和酚为有毒、刺激性物体,需要在通风橱中操作。

 

 

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